Identificando sitios de acción desconocidos

Si bien la estrategia recién discutida se sigue usando para el descubrimiento de herbicidas, todavía existen amplias lagunas en nuestro conocimiento de otros sitios no enzimáticos, con potencial para la actividad de los herbicidas.  Por ejemplo, las funciones de una vasta proporción de los genes de Arabidopsis son parcialmente (cerca del 50%) o completamente (más del 30%) desconocidas.  Es probable que muchos de estos genes codifican proteínas que son componentes de señales de transducción en cascada, factores de transcripción, o tienen otras funciones de regulación.  Todos ellos tienen potencial como sitios de acción para herbicidas, puesto que la inhibición de sus funciones puede ser letal o dañina para la planta.  Sin embargo, en la mayoría de los casos se requiere identificar a los genes y determinar las funciones de las proteínas que codifican, antes de que se les pueda dar seguimiento para lo mencionado.  Existen varias estrategias para lograr lo anterior, incluyendo el silenciar o interferir con la expresión del gen, predecir la función de la proteína, y comparar los perfiles de ARNs, proteínas, o metabolitos. 

El propósito general de todas estas estrategias es eliminar o reducir el nivel de expresión de genes individuales, escoger aquellos que crean un  fenotipo de crecimiento negativo y luego trabajar hacia atrás para identificar su función.

En un sistema HTS, se llevan a cabo estas técnicas, de manera simultánea, con un número grande de genes.  Información detallada sobre la estructura molecular y las interacciones de la proteína objetivo con otras proteínas deben entonces obtenerse, una vez que se conoce la función.

Interferencia con la expresión de los genes:  la interferencia con el  ARN (RNAi) es una técnica para reducir parcialmente el nivel de la expresión de los genes, introduciendo segmentos de ARN de doble filamento en las plantas, por medio de la transformación.  La célula vegetal posee sistemas  endógenos para degradar los  ARNs de doble filamento y así, de manera simultánea, destruir los transcriptos de un filamento normales.  Metodologías similares son el  ARN antisentido  y el silenciamiento de genes inducido por virus (VIGS).  VIGS tiene la ventaja de que se puede usar en especies de plantas que son recalcitrantes a la transformación por análisis de alto rendimiento. 

Predicción de las funciones de las proteínas:  las secuencias de  ADN obtenidas de los proyectos de  secuenciamiento del genoma y otras fuentes pueden traducirse en secuencias proteicas putativas.  Una vez obtenidas, las secuencias de las proteínas se pueden comparar con otras secuencias conocidas, en bases de datos, y las similitudes pueden ayudar a predecir las posibles funciones.  Avances recientes en la búsqueda de homología asistida por computadora, cristalización proteica de alta velocidad y determinación de la estructura, y el desarrollo de bases de datos grandes de estructuras proteicas tridimensionales, ayudarán de manera significativa, a reducir las posibles funciones de genes desconocidos. 

Perfiles de ARN, proteínas, y metabolitos:  el  análisis  de perfiles o colecciones de  mARNs (transcriptómicos), proteínas (proteómicos), y metabolitos (metabolómicos) puede proveer una indicación global del estado fisiológico de una célula, tejido, o planta entera.  Las comparaciones entre muestras tratadas (con un herbicida potencial) y no tratadas pueden resaltar rutas o procesos particulares que son inhibidos, y por ende proveer claves sobre el mecanismo de la toxicidad.  Arreglos de  mARN (Figura 2) a menudo se conocen como microarreglos, y se diseñan para monitorear y cuantificar los cambios en la expresión de genes  en organismos o tejidos, en respuesta a un tratamiento, en este caso un herbicida potencial.  Fragmentos pequeños de genes, como cADNs conocidos individualmente, o marcadores de secuencia expresada (EST, por sus siglas en Inglés) son colocados, por duplicado, en un soporte sólido, e hibridizados individualmente con ARN marcado extraído de tejidos o células tratados y no tratados.  La fuerza relativa de las señales de hibridización resultantes son una medida directa de la cantidad de cada mARN particular.  Estas señales entonces reflejan el grado de aumento o disminución en la expresión del gen, como respuesta al tratamiento.  Tales ensayos se han usado para comparar tejidos tratados y no tratados con herbicidas, como un esfuerzo por dilucidar los mecanismos de acción.

La comparación de arreglos de proteínas entre plantas tratadas y no tratadas provee información similar.  Cuando se combina con  ARNi u otra técnica de interferencia de la expresión genética, estas técnicas pueden conducir rápidamente a la identificación de un gen objetivo.

En una aplicación de la metabolómica, la resonancia magnética nuclear de protón individual (NMR) para definir perfiles de metabolitos, acoplado con análisis de componente principal/mapeo por componentes se usó para comparar los perfiles de metabolitos de plantas tratadas y no tratadas con compuestos conocidos y desconocidos.  Usando un sistema  HTS, este enfoque fue exitoso para confirmar herbicidas conocidos así como para predecir, de manera certera, la actividad herbicida de varios compuestos desconocidos.  La técnica luego se refinó y usó para asignar perfiles de metabolitos a 400 extractos de plantas para pruebas futuras con herbicidas potenciales.