Descubrimiento y selección basados en sitio de acción
La reciente explosión de tecnologías de biología molecular ha proveído herramientas en extremo poderosas para el descubrimiento de herbicidas. Por ejemplo, el secuenciamiento genómicocompleto de Arabidopsis y otras plantas modelo ha identificado muchos genes cuyas proteínaspodrían representar sitios de acción potenciales para nuevos herbicidas. Existen cerca de 28,000 genes en Arabidopsis, de los cuales cerca del 20% están anotados como enzimas. Como se indicó antes, sólo unas cuantas de estas enzimas son sitios de acción para herbicidas comerciales, en la actualidad. Por lo tanto, un enfoque lógico sería escoger una o más de estas enzimas desconocidas e intentar desarrollar inhibidores químicos como herbicidas. Este enfoque es un ejemplo muy sencillo del "diseño racional" o estrategias "por sitio de acción" que ahora se exploran, en las cuales el énfasis primero se pone en el sitio bioquímico, y luego en el químico. Sin embargo, esta estrategia requiere que primero se cumplan ciertos supuestos, antes de embarcarse en un programa de descubrimiento. Algunos de estos son:
- La inhibición de la enzima escogida resultará en suficiente inhibición del crecimiento para proveer niveles aceptables de control de malezas? en términos prácticos, un 100% de inhibición de la enzima escogida casi nunca es posible bajo condiciones de campo. Abell (1996) sugirió que la enzima sería un buen objetivo si un 60% a 80% de su inhibición conduce a un fenotipo severamente afectado en su crecimiento.
- Se puede obtener suficiente cantidad de la enzima y en la conformación catalítica correcta para conducir ensayos in vitro en el formato HTS? este requisito asume que el gen y/o el cDNA ha sido clonado y está disponible, puede ser expresado de manera apropiada en un sistema de expresión eukariótica, y que la enzima puede ser purificada reteniendo su actividad.
- Puede medirse la actividad de la enzima en un ensayo in vitro que sea compatible con sistemas HTS, altamente mecanizados? la actividad catalítica de la mayoría de las enzimas puede a menudo relacionarse con reacciones colorimétricas o de fluorescencia, para crear ensayos relativamente simples. Sin embargo, determinar la inhibición del sitio de acción de una enzima o los sitios de interacción proteína-proteína es mucho más difícil, e introduce otro nivel de complejidad.
- Se conoce a nivel molecular la información sobre el sitio activo (y sitios de regulación) de la enzima? estos son quizás los criterios más importantes, ya que todos los métodos de simulación química antes descritos requieren este nivel de detalle para lograr predecir el acople y la actividad de inhibidores nuevos y sus análogos estructurales. Dicha información se obtiene del analisis de la estructura cristalizada de la enzima.
Si se cumplen estos supuestos, se puede conducir con rapidez trabajo detallado con herbicidas inhibidores potenciales, usando sistemas de selección HTS. También, estrategias como la comparación de las secuencias de proteínas o información sobre el sitio de acción de monocotiledóneas y dicotiledóneas puede identificar enzimas como objetivos potenciales de herbicidas selectivos.